质粒是基因工程中常用的载体，其作用是                                  ；质粒$\rm DNA$分子需具有一个或者多个限制酶切割位点，进入受体细胞能够自我复制，或整合到受体$\rm DNA$上同步复制，还需要有                ，便于重组$\rm DNA$分子的筛选。

将目的基因送入受体细胞；标记基因

质粒的作用为将目的基因送入受体细胞；质粒$\rm DNA$分子需具有一个或者多个限制酶切割位点、需要复制原点、启动子、终止子和标记基因，其中标记基因便于重组$\rm DNA$分子的筛选。

过程①中，构建$\rm CRISPR/Cas9$重组质粒需对含有特定$\rm sgRNA$编码序列的$\rm DNA$进行酶切，切割所需要的酶是                ，然后将其插入到经相同酶切过的质粒上，这里一般需要用同种酶切割的原因是                                                                                  。

限制性内切核酸酶（限制酶）；用同种限制酶切割才能产生相同的（黏性）末端

切割$\rm DNA$序列需要用限制性内切核酸酶；切割目的基因与载体需要用同种酶切割的原因是用同种限制酶切割才能产生相同的末端，便于连接。

过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞时需要用                 处理细胞，使细胞处于能吸收周围环境的$\rm DNA$分子的生理状态；欲筛选成功转化的大肠杆菌，可通过提取细胞内的蛋白质进行检测，其运用的原理是                 。

将载体导入微生物细胞内常用农杆菌转化法，导入时需将大肠杆菌细胞用$\rm Ca^{2+}$处理细胞，使细胞处于能吸收周围环境的$\rm DNA$分子的生理状态；通过提取细胞内的蛋白质进行检测是否转化成功，其运用的原理是抗原与抗体特异性结合。

过程③~⑤中，$\rm sgRNA$与$\rm Cas9$蛋白形成复合体，该复合体中的$\rm sgRNA$可识别并与目标$\rm DNA$序列特异性结合，该过程中所遵循的原则与$\rm DNA$复制过程中的差异是                                 。

前者是 $\\rm U—A$，后者是$\\rm T—A$

复合体中的$\rm sgRNA$可识别并与目标$\rm DNA$序列特异性结合碱基的配对情况为$\rm U—A$，$\rm G—C$，而$\rm DNA$复制过程碱基的配对情况为$\rm T—A$，$\rm G—C$，所以差异为前者是 $\rm U—A$，后者是$\rm T—A$。

利用$\rm CRISPR/Cas9$基因编辑技术敲除一个长度为$\rm 1500bp$的基因，在$\rm DNA$水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是                 。

判断基因敲除是否成功可采用$\rm DNA$分子杂交技术，若出现杂交带说明没成功。