构建基因表达载体时用到的酶是限制酶和                 ，图甲中三种质粒适宜作为载体的是质粒                 。

构建基因表达载体需限制酶切割目的基因和载体，$\rm DNA$连接酶连接二者，所以用到限制酶和$\rm DNA$连接酶。载体需有复制原点、标记基因等。质粒$\rm A$无标记基因（$\rm AmpR$等）；质粒$\rm B$的$\rm LacZ$基因、复制原点等完整，且有标记基因；质粒$\rm C$的复制原点被$\rm Pvu$Ⅰ 切割（会破坏复制功能），所以适宜作为载体的是质粒$\rm B$。

若$\rm LacZ$基因的编码区（无内含子、无终止密码编码序列）含有$\rm 735$个碱基对（$\rm bp$），其编码的肽链含有                 个氨基酸。

基因编码区碱基对（$\rm 735bp$），转录出的$\rm mRNA$上密码子决定氨基酸，不考虑终止密码（题目说无终止密码编码序列），则氨基酸数 $\rm =$ 碱基对数量 $\rm \div 3=735\div 3=245$个。

获取目的基因$\rm D$时对应选择图乙中的                 对其所在的$\rm DNA$进行切割。将目的基因$\rm D$和图甲中相应质粒连接后，得到图丙中三种方式。为选出正向连接的重组质粒，使用                 对质粒完全酶切后，进行电泳分析。若是反向连接载体，电泳图谱中出现长度为                 $\rm kb$和                 $\rm kb$两条带。

目的基因$\rm D$两端是$Pvu$Ⅰ 酶切位点，用$Pvu$Ⅰ 切割可获取完整目的基因（若用$ Eco$$\rm R$Ⅰ 会破坏目的基因）。由于$Eco$$\rm RI$在目的基因和质粒上都有酶切位点，为选出正向连接的重组质粒，使用$Eco$$$\rm$ $RI$对质粒完全酶切后，进行电泳分析。质粒$\rm B$中$Eco$$$\rm$ $RI$酶切位点与$Pvu$Ⅰ酶切位点之间的距离为$\rm 0.2Kb$，若是反向连接载体，重组质粒中$\rm 2$个$Eco$$$\rm$ $RI$酶切点之间的距离是$\rm 0.2+3=3.2Kb$，重组质粒长度为：$\rm 2.5+1=3.5Kb$，故$Eco$$$\rm$ $RI$酶切后，反向连接载体的情况下，电泳图谱中出现长度为$\rm 3.5kb$和$\rm 3.2kb$两条带。

利用$\rm PCR$获取如图所示目的基因$\rm D$的引物组合是                 ，用该图的$\rm DNA$片段做模板，扩增$\rm 5$次后可得到                 个等长的目的基因片段。引物的设计是影响$\rm PCR$扩增反应的效率和特异性的关键因素，下列相关叙述正确的是                 （单选）

$\rm A$．引物的碱基数量越少则复性温度越低，目标$\rm DNA$获得率越高

$\rm B$．根据需要可在引物的$\rm 5^\prime$端添加限制酶识别序列、点突变序列等

$\rm C$．两种引物的复性温度差异较大，可减少引物与模板的非特异性结合

$\rm D$．引物的$\rm G$、$\rm C$含量越高，结合特异性越强，越利于目标$\rm DNA$的扩增

$\rm PCR$扩增目的基因$\rm D$，引物需分别与目的基因两端互补。引物①（$\rm 3^\prime$端）和引物④（$\rm 3^\prime$端）可结合目的基因两端，所以引物组合是引物①和引物④；$\rm PCR$ 扩增中，$\rm DNA$复制呈指数增长，每次循环后 $\rm DNA$ 数量翻倍。扩增$\rm n$次后，总$\rm DNA$分子数是$\rm 2^{n}$。但等长的目的基因片段数为（$\rm 2^{n}-2n$），因此扩增$\rm 5$次后可得到（$\rm 2^{5}-2\times 5$）$\rm =22$个等长的目的基因片段；

$\rm A$、引物碱基数量少，特异性弱，非目标 $\rm DNA$ 也可能结合，目标 $\rm DNA$ 获得率不一定高，$\rm A$ 错误；

$\rm B$、可在引物$\rm 5$’端添加限制酶识别序列（用于后续酶切 ）、点突变序列（引入突变 ）等，$\rm B$正确；

$\rm C$、两种引物复性温度差异大，易导致引物与模板结合不同步，增加非特异性结合，$\rm C$错误；

$\rm D$、引物 $\rm G$、$\rm C$ 含量高，稳定性强，但不是越高越好，过高可能影响复性，$\rm D$错误。

故选：$\rm B$。

利用自身不含$\rm LacZ$基因且对抗生素敏感的大肠杆菌作为受体细胞，要在已转化的含重组质粒、已转化的含空质粒的受体细胞和未转化成功的细胞中筛选出已转化的含重组质粒的受体细胞的方法是在含有                 的培养基上培养，形成                 色菌落的为导入重组质粒的受体细胞。

重组质粒构建时，$\rm LacZ$基因被破坏（插入目的基因），标记基因$\rm Amp^{R}$（氨苄青霉素抗性基因 ）保留。所以在含氨苄青霉素的培养基上培养，未转化（无$\rm Amp^{R}$）的细菌不能生长；含空质粒（$\rm LacZ$完整）的细菌，$\rm LacZ$表达使菌落呈蓝色；含重组质粒（$\rm LacZ$破坏）的细菌，不能将$\rm X-gal$转化为蓝色，菌落呈白色。所以在含氨苄青霉素和$\rm X-gal$ 的培养基上，形成白色菌落的是导入重组质粒的受体细胞。