筛选、培养纤维素分解菌需要以纤维素为唯一                设计选择性培养基，配置好的培养基需要用                灭菌。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。结合已有信息，请你完善以下实验步骤：

①瘤胃提取物取样；

②                                                                ；

③在适宜条件下培养一段时间；

④选取                                                                ；

⑤重复多次②③④实验步骤，直至筛选出高效纤维素分解菌。

碳源；高压蒸汽灭菌；梯度稀释后涂布到添加有刚果红的选择培养基；透明圈大的菌落（透明圈与菌落比值大）

纤维素的元素组成为$\rm C$、$\rm H$、$\rm O$，上图是科研小组从瘤胃中分离培养分解纤维素的微生物的流程，因此得到瘤胃提取物后，将其放入以纤维素为唯一碳源的选择培养基进行培养，配置好的培养基需要用高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）。

若要筛选出高效纤维素分解菌，首先在瘤胃提取物取样，梯度稀释后涂布到添加有刚果红的选择培养基，在适宜条件下培养一段时间，选取透明圈大的菌落（透明圈越大的菌落，菌分解纤维素的能力越强），重复多次②③④实验步骤，直至筛选出高效纤维素分解菌。

分离出某真菌的 $\rm W$ 基因可编码一种可高效降解纤维素的酶，以图 $\rm 2$ 中质粒为载体，进行转基因操作。为使大肠杆菌产生该酶，在质粒中插入 $\rm W$ 基因构建基因表达载体后，研究人员一般先用                 处理大肠杆菌细胞，使其处于能吸收周围环境中 $\rm DNA$ 分子的生理状态。

为使大肠杆菌产生该酶，在质粒中插入 $\rm W$ 基因构建基因表达载体后，研究人员一般先用$\rm Ca^{2+}$处理大肠杆菌细胞，使其处于能吸收周围环境中 $\rm DNA$ 分子的生理状态。

①如图 $\rm 3$ 所示，已知图中 $\rm W$ 基因转录方向是从右向左，$\rm W$ 基因转录的模板链是                。利用                技术对 $\rm W$ 基因进行扩增时，选取的引物为                （用①②③④回答）。

②结合图 $\rm 2$ 及图 $\rm 3$，解释 $ Eco\rm R$Ⅰ酶不可用的原因：                                                                。

甲；$\\rm PCR$；②③；在质粒中$ Eco\\rm R$Ⅰ酶的识别序列在$Hin\\rm d$ Ⅲ识别序列的左侧，若用该酶切割，会导致目的基因反向连接

①已知图中$\rm W$基因转录方向是从右向左，$\rm mRNA$链的合成方向为$\rm 5'→3'$，与甲链从右向左$\rm 3'→5'$互补，故$\rm W$基因转录的模板链是甲链。利用$\rm PCR$技术扩增目的基因的原理是$\rm DNA$半保留复制，子链延伸方向为$\rm 5'→3'$，因此在扩增目的基因时选取的引物为②③。

②题意显示“图中$\rm W$基因转录方向是从右向左、“质粒启动子到终止子方向为顺时针”，故重组质粒的启动子应在$\rm W$基因右侧，终止子应在$\rm W$基因左侧，$\rm W$基因右侧只能用$Hin\rm d$Ⅲ切割，$\rm W$基因左侧有$Bam\rm H$Ⅰ、$Kpn$Ⅰ、$Eco\rm R$Ⅰ三种酶切位点，结合质粒情况及切割位点识别序列，应使用限制酶$Hin\rm d$Ⅲ和$Kpn$Ⅰ切割图中质粒和$\rm W$基因，以获得能正确表达$\rm W$基因的重组质粒，结合图示可知，在质粒中$Eco\rm R$Ⅰ酶的识别序列在$Hin\rm d$Ⅲ识别序列的左侧，若用该酶切割，会导致目的基因反向连接。