步骤①将$\rm pTM$启动子插入到质粒$\rm 1$中，其中$\rm pTM$启动子的作用是：                                                               。

$\\rm RNA$聚合酶识别和结合的部位，可以驱动$\\rm pTM$基因转录出$\\rm mRNA$，最终表达出$\\rm pTM$蛋白

据图$\rm 1$可知，步骤①是在质粒$\rm 1$中插入$\rm pTM$的启动子，$\rm pTM$为猪血栓调节蛋白，$\rm pTM$启动子的作用是$\rm RNA$聚合酶识别和结合的部位，可以驱动$\rm pTM$基因转录出$\rm mRNA$，最终表达出$\rm pTM$蛋白。

步骤②设计引物时，应该在引物                 端加入$cla$Ⅰ和$Eco\rm R$Ⅴ两种限制酶的识别序列。

引物的延伸是从$\rm 3'$端开始的，不能进行任何修饰，因此要加入$cla$Ⅰ和$Eco\rm R$Ⅴ两种限制酶的识别序列，需要在引物的$\rm 5'$端。

步骤③将$\rm hTM$编码区插入质粒$\rm 2$中，该过程中至少需要                 种酶，分别是：                 。

据题意可知，目的基因和质粒都用$\rm claI$和$\rm EcoRV$两种限制酶，得到的片段有黏性末端和平末端，需要用$\rm T4DNA$连接酶连接（用于连接黏性末端和平末端），因此步骤③将$\rm hTM$编码区插入质粒$\rm 2$中，该过程中至少需要$\rm 3$种酶，即$cla$Ⅰ、$Eco\rm R$Ⅴ、$\rm T4DNA$连接酶。

步骤③获得的质粒$\rm 3$经$Xho$Ⅰ、$Eco\rm R$Ⅴ酶切后电泳，结果如下图$\rm 2$，据结果可判断目的基因                 （填“成功插入”或“未插入”）质粒。

将步骤③获得的质粒$\rm 3$经$Xho$Ⅰ、$ Eco\rm R$Ⅴ酶切后电泳应当得到$\rm 2$种长度的片段，其中应该含有$\rm pTM$的启动子$\rm +hTM$编码区$\rm =0.6+1.7=2.3$，据图$\rm 2$实际电泳结果得到了$\rm 5.6\;kb$和$\rm 2.3\;kb$的$\rm 2$种片段，这说明$\rm hTM$目的基因已经成功地插入到质粒$\rm 3$。

质粒$\rm 3$导入猪胎儿成纤维细胞常用的方法是                 。将处理后的成纤维细胞接种至培养皿中培养$\rm 48\;\rm h$后经                 处理分散成单个细胞，再按每孔一个细胞接种至$\rm 96$孔板（如上图）中，加入                 筛选获得抗性细胞，再提取抗性细胞的$\rm DNA$进行$\rm PCR$鉴定，将呈阳性的细胞留存待用。

质粒$\rm 3$导入猪胎儿成纤维细胞常用的方法是显微注射法。质粒$\rm 3$经电转染导入猪胎儿成纤维细胞并接种至培养皿中培养$\rm 48\;\rm h$后经胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞，再按每孔一个细胞接种至$\rm 96$孔板中。质粒中的$\rm puro$嘌呤霉素抗性基因作为标记基因，培养液中加入嘌呤霉素筛选可获得抗性细胞，即含有质粒或重组质粒的细胞，再提取抗性细胞的$\rm DNA$进行$\rm PCR$鉴定，将呈阳性的细胞留存待用。

取留存细胞的细胞核，显微注射到                                                                中，再经过                                                                等技术（至少两种）获得表达人血栓调节蛋白的转基因猪。

去核的$\\rm MII$期卵母细胞；动物细胞培养、胚胎移植

最后取留存细胞的细胞核，通过显微注射到去核的$\rm M$Ⅱ中期卵母细胞中，再经过早期胚胎培养、胚胎移植技术获得能表达人血栓调节蛋白的转基因猪。