$\rm CRISPR$系统由向导$\rm RNA$和$\rm Cas9$核酸酶组成，向导$\rm RNA$可与$\rm DNA$的一条链通过                                                                                  原则结合，$\rm Cas9$酶能将与之结合的双链$\rm DNA$切割，如图$\rm 1$所示。$\rm Cas9$酶与基因工程使用的限制酶作用的差异是                                                                                  。

碱基互补配对 $\\rm Cas9$核酸酶不具有识别$\\rm DNA$分子中特定核苷酸序列的作用，切割的是与向导$\\rm RNA$ 结合的$\\rm DNA$中的磷酸二酯键，使$\\rm DNA$双链断裂；限制酶能够识别双链 $\\rm DNA$分子的特定核苷酸序列，切割的是$\\rm DNA$每一条链中特定部位的磷酸二酯键，使$\\rm DNA$双链断裂

$\rm CRISPR$系统由向导$\rm RNA$和$\rm Cas9$核酸酶组成，向导$\rm RNA$可与$\rm DNA$的一条链通过碱基互补配对原则结合，$\rm Cas9$酶能将与之结合的双链$\rm DNA$切割。基因工程使用的限制酶能够识别双链 $\rm DNA$分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。$\rm Cas9$核酸酶不具有识别$\rm DNA$分子中特定核苷酸序列的作用，需要向导$\rm RNA$进行定位后，切割与之结合的双链$\rm DNA$中的磷酸二酯键，使$\rm DNA$双链断裂。

为后续筛选$\rm K$基因“敲除”的果蝇，在$\rm K$基因$\rm DNA$断裂位点插入红色荧光蛋白基因（$\rm RFP$）需提供携带有红色荧光蛋白基因的供体质粒。

①应选用                 处理图$\rm 2$所示的质粒和红色荧光蛋白基因，以构建供体质粒，同时避免质粒自连。

②将$\rm Cas9$酶基因、向导$\rm RNA$基因和供体质$\rm RFP$基因粒导入果蝇的                 中，若检测到红色荧光，则表明$\rm K$基因可能被成功“敲除”，该受精卵发育成的果蝇即为$\rm F$₀代果蝇。

①为了构建供体质粒，同时避免质粒自连，应选用两种不同的限制酶切割红色荧光蛋白基因和质粒。分析图$\rm 2$可知：$\rm KpnI$会切开卡那霉素抗性基因，不利于后续筛选；$\rm DraIII$会切开复制原点，影响质粒的复制；使用$\rm HindIII$与其他酶一起切割质粒时会使质粒上的启动子缺失，影响基因的表达，所以选用$\rm BamHI$和$\rm NotI$。

②将构建好的表达载体导入果蝇细胞中时，应选用受精卵作为受体细胞，因为动物的受精卵具有全能性，能发育成完整个体。

为确认$\rm K$基因是否被成功“敲除”，科研人员进行了如下实验：

①科研人员用图$\rm 3$中的引物$\rm I$、$\rm II$、$\rm III$对$\rm F$₀代果蝇$\rm DNA$进行$\rm PCR$并电泳检测（大于$\rm 10kb$片段单次$\rm PCR$无法完成扩增）。若敲除成功，则观察到的不同个体电泳条带可能有两种情况：                或                （长度单位：$\rm kb$），出现这两种情况的原因是                                                                                。

②近年来，科研人员又发现了一种检测基因的方法$\rm ——Cas12a$酶法。该酶类似$\rm Cas9$能够在向导$\rm RNA$的作用下，在特定位点剪切目标$\rm DNA$之后，还发挥非定向切割单链$\rm DNA$的功能（如图）。用该方法检测敲除是否成功并排除“脱靶”的方法是：利用                序列设计向导$\rm RNA$，取待检测细胞克隆导入                和报告分子，观测指标是                。

$\\rm 4kb$（或$\\rm 3.5kb$）；$\\rm 4kb$和$\\rm 5.5kb$（或$\\rm 3.5kb$和$\\rm 5.5kb$）；$\\rm RFP$序列按图中方向正向插入断裂区域，敲除成功的$\\rm F_{0}$代果蝇可能是敲除杂合体或纯合体、或敲除成功的$\\rm F_{0}$代果蝇插入了一个或两个$\\rm RFP$基因（或者$\\rm RFP$序列按图中方向反向插入断裂区域，敲除成功的$\\rm F_{0}$代果蝇可能是敲除杂合体或纯合体、或敲除成功的$\\rm F_{0}$代果蝇插入了一个或两个$\\rm RFP$基因）；目标$\\rm DNA$；向导$\\rm RNA$基因和$\\rm Cas12a$酶基因；是否产生绿色荧光

①若$\rm K$基因敲除成功并导入$\rm RFP$基因，$\rm F$₀代果蝇能发出红的荧光，由于$\rm K$基因在果蝇内成对存在，$\rm K$基因可能敲除了一个（$\rm K$基因敲除杂合子）或两个（$\rm K$基因敲除纯合子），断裂位点也不一定都能插入$\rm RFP$，且插入的$\rm RFP$方向不确定，所以要分情况分析。

情况一：按照图中的方向将$\rm RFP$基因序列正向插入断裂位置，若果蝇为$\rm K$基因敲除纯合子且在$\rm K$基因$\rm DNA$断裂位点都插入了$\rm RFP$，由于大于$\rm 10kb$片段单次$\rm PCR$无法完成扩增，$\rm PCR$只能获得引物$\rm I$和引物$\rm III$之间$\rm 4kb$的片段；若果蝇为$\rm K$基因敲除纯合子但只有一条染色体上的$\rm K$基因断裂位点插入$\rm RFP$，或者果蝇为$\rm K$基因敲除杂合子，则除了获得引物$\rm I$和引物$\rm III$之间$\rm 4kb$的片段，还可以获得未插$\rm RFP$基因时或未被敲除的$\rm K$基因上引物$\rm I$与引物$\rm II$之间$\rm 5.5kb$的片段。

情况二：将图中$\rm RFP$基因序列反向插入断裂位置，若果蝇为$\rm K$基因敲除纯合子且在$\rm K$基因$\rm DNA$断裂位点都插入了$\rm RFP$，由于大于$\rm 10kb$片段单次$\rm PCR$无法完成扩增，$\rm PCR$只能获得引物$\rm II$和引物$\rm III$之间$\rm 3.5kb$的片段；若果蝇为$\rm K$基因敲除纯合子但只有一条染色体上的$\rm K$基因断裂位点插入$\rm RFP$，或者果蝇为$\rm K$基因敲除杂合子，则除了获得引物$\rm II$和引物$\rm III$之间$\rm 3.5kb$的片段，还可以获得未插$\rm RFP$基因时或未被敲除$\rm K$基因时引物$\rm I$与引物$\rm II$之间$\rm 5.5kb$的片段。

②$\rm Cas12a$酶法类似$\rm Cas9$能够在向导$\rm RNA$的作用下，在特定位点剪切目标$\rm DNA$之后，还发挥非定向切割单链$\rm DNA$的功能。所以应利用特定位点剪切的目标$\rm DNA$序列，根据碱基互补配对的原则，设计向导$\rm RNA$，取待检测细胞克隆导入向导$\rm RNA$基因、$\rm Cas12a$酶基因和报告分子。在细胞体内，向导$\rm RNA$与目标$\rm DNA$结合，然后$\rm Cas12a$酶在向导$\rm RNA$结合位点剪切目标$\rm DNA$，然后$\rm Cas12a$酶发挥非定向切割单链$\rm DNA$的功能，剪切报告分子，报告分子中的淬灭基团和绿色荧光基团分离，绿色荧光基团发出绿色荧光，所以可以通过观察是否产生绿色荧光判断敲除是否成功并排除“脱靶”。

为进一步研究$\rm K$基因功能，科研人员做了如下表的实验，由此推测$\rm K$基因的功能是                                  。

维持雄性果蝇的正常育性

野生型♂$\rm \times $野生型♀、野生型♂$\rm \times K$基因“敲除”果蝇♀两组相比，子代个体数相近，说明$\rm K$基因“敲除”不影响雌性个体的育性；而$\rm K$基因“敲除”果蝇♂$\rm \times $野生型♀杂交没有子代，说明$\rm K$基因“敲除”影响雄性个体的育性，即$\rm K$基因的作用是维持雄性果蝇的正常育性。