$\rm Cas9$是一种核酸内切酶，它与$\rm sgRNA$（向导$\rm RNA$）构成的复合体能与目标$\rm DNA$分子特定碱基序列结合，如图$\rm 1$。作用时$\rm sgRNA$与目标$\rm DNA$单链进行碱基互补配对，然后$\rm Cas9$催化                 键水解，从而使$\rm DNA$在特定部位被切断。

$\rm Cas9$是一种核酸内切酶，其作用特点是使两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，故$\rm Cas9$催化脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键水解。

一般来说，在使用$\rm CRISPR/Cas9$系统对不同基因进行编辑时，应使用$\rm Cas9$和                 （填“相同”或“不同”）的$\rm sgRNA$结合构成复合体进行相关基因的编辑，其中$\rm Cas9$对$\rm DNA$的切割                 （填“具有”或“不具有”）类似于限制酶的“限制性”。

根据碱基互补配对原则，在使用$\rm CRISPR/Cas9$系统对不同基因进行编辑时，应使用$\rm Cas9$和不同的$\rm sgRNA$进行基因的相关编辑，因为$\rm Cas9$与$\rm sgRNA$（向导$\rm RNA$）构成的复合体能与$\rm DNA$分子特定碱基序列结合，而$\rm Cas9$本身不能够识别双链$\rm DNA$分子的某种特定核苷酸序列，也因此$\rm Cas9$对$\rm DNA$的切割不具有类似于限制酶的“限制性”。

$\rm HepG2$细胞中没有编码$\rm Cas9$的基因，需将$\rm Cas9$基因及$\rm sgRNA$基因拼接形成拼接基因并与质粒结合导入$\rm HepG2$细胞，$\rm sgRNA$的合成需要                 酶的催化。

$\rm RNA$的合成需要$\rm RNA$聚合酶的参与，因此，$\rm sgRNA$的合成也需要$\rm RNA$聚合酶的催化。

用图$\rm 2$中的质粒以及含$\rm Cas9-sgRNA$拼接基因的$\rm DNA$片段构建表达载体时，应选用                 进行酶切。将构建好的表达载体与用                 处理的细菌置于适宜反应体系中培养。然后将培养的细菌涂布于含                 的平板培养基上，$\rm 37^\circ\rm C$培养，$\rm 24\;\rm h$后挑取菌落，提取质粒作为模板，选择图$\rm 3$中引物组合                 和                 ，通过$\rm PCR$和琼脂糖凝胶电泳技术鉴定是否重组成功。

根据图$\rm 2$，应选用$Eco$$\rm RI$进行酶切，因为$ Bam$$\rm HI$基因会切割嘌呤霉素抗性基因，导致重组质粒没有标记基因；将构建好的表达载体与用$\rm Ca^{2+}$（$\rm CaCl_{2}$）处理的细菌置于适宜反应体系中培养；由于重组质粒的标记基因为嘌呤霉素抗性基因，因此将培养的细菌涂布于含嘌呤霉素的平板培养基上培养；若重组成功，则应该同时具有拼接基因和插入部位两端的碱基序列，故选：择图$\rm 3$中的引物$\rm I$（可与拼接基因碱基序列互补）和Ⅲ（可与插入部位左端碱基序列互补）。

用鉴定成功的工程菌对$\rm HepG2$细胞进行转染，培养三天后收集$\rm HepG2$细胞，从分子水平和细胞水平检测导入是否成功。

①提取$\rm HepG2$细胞的基因组，对$\rm DNA$分子的                序列进行检测。

②请写出细胞水平的一项检测指标：                                                                                  。

碱基（或脱氧核苷酸）；$\\rm HepG2$细胞的细胞核形态或单位时间内细胞数目的增长量等

从分子水平检测，可以直接对$\rm DNA$分子碱基序列进行检测；根据题干信息，人类肿瘤细胞中$\rm LMNA$基因表达异常，$\rm LMNA$基因编码的核纤层蛋白与维持细胞核的正常形态有关，因此，在细胞水平可以检测$\rm HepG2$细胞的细胞核形态或单位时间内细胞数目的增长量等。