$\rm Ti$质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为                 。选用图甲中的$ Sma$Ⅰ对抗除草剂基因$\rm X$进行完全酶切，再选择$Sma$Ⅰ和                 对$\rm Ti$质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是                 。利用$\rm DNA$连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因$\rm X$的片段与酶切并补平的$\rm Ti$质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶                 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短$\rm 2$条带，较短的条带长度近似为                 $\rm bp$，则一定为正向重组质粒。

$\rm DNA$复制的起点是复制原点，因此$\rm Ti$质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据$Sma$Ⅰ限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用$Sma$Ⅰ酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向接入也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗除草剂因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择$Bam\rm H$Ⅰ，因为该限制酶会破坏终止子，因此可选择$Xba$Ⅰ和$Sma$Ⅰ进行酶切（可使重组质粒最小），$Xba$Ⅰ酶切会形成黏性末端，需要用$\rm DNA$聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体将产生的黏性末端补平。利用$\rm DNA$连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因$\rm X$的片段与酶切并补平的$\rm Ti$质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的$\rm T-DNA$片段上含有一个$Sma$Ⅰ酶切位点和一个$Spe$Ⅰ酶切位点，可以选择用$Sma$Ⅰ和$Spe$Ⅰ进行酶切，转录的方向是从模板的$\rm 3'→5'$，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现一长一短$\rm 2$条带，较短的条带长度近似为$\rm 550\;bp$，若反向接，较短的条带长度近似为$\rm 200\;bp$。

为证明这两个突变体是由于$\rm T-DNA$插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组$\rm DNA$，经酶切后产生含有$\rm T-DNA$的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续$\rm PCR$难以扩增大片段$\rm DNA$，最好使用识别序列为                 （填“$\rm 4$”“$\rm 6$”或“$\rm 8$”）个碱基对的限制酶，且$\rm T-DNA$中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段                 ，才能利用引物$\rm P1$和$\rm P2$成功扩增未知序列。$\rm PCR$扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出$\rm 2$条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为                 （填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。

由于后续$\rm PCR$难以扩增大片段$\rm DNA$，所以最好选择识别序列为$\rm 4$个碱基的限制酶，原因是识别序列越短，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续的$\rm PCR$扩增。由于引物是根据已知序列设计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否是同一基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此对同一个基因的操作为测序和序列比对。

通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，                 （填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。

突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。