制备特定抗原

①获取基因$\rm A$，构建重组质粒（该质粒的部分结构如图所示）。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和                等；为确定基因$\rm A$已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物                对待测质粒进行$\rm PCR$扩增，预期扩增产物的片段大小为                $\rm bp$。

②将$\rm DNA$测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白$\rm A$合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白$\rm A$，可能的原因是                                                                （答出两点即可）。

终止子、复制原点；$\\rm P1$ 和 $\\rm P3$；$\\rm 782$；重组菌没有裂解或没有将蛋白$\\rm A$释放到细胞外、转速过高使蛋白$\\rm A$发生沉淀、蛋白$\\rm A$亲水性较差发生沉淀、蛋白$\\rm A$被大肠杆菌的蛋白酶降解

重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和终止子，复制原点等，终止子能终止转录过程。 要确定基因 $\rm A$ 已连接到质粒中且插入方向正确，应选用引物 $\rm P1$ 和 $\rm P3$。因为 $\rm P1$ 与基因 $\rm A$ 下游的非编码区互补配对，$\rm P3$ 与基因 $\rm A$ 上游且靠近启动子的区域互补配对，这样扩增的片段大小为$\rm 200+582=782\;bp$。

将 $\rm DNA$ 测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌，培养后上清液中无蛋白 $\rm A$，可能的原因有：重组菌没有裂解或没有将蛋白$\rm A$释放到细胞外，转速过高使蛋白$\rm A$发生沉淀，蛋白$\rm A$亲水性较差发生沉淀，蛋白$\rm A$被大肠杆菌的蛋白酶降解。

制备抗蛋白$\rm A$单克隆抗体

用蛋白$\rm A$对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠$\rm B$淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有                                                                （答出一种即可）。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和                ，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白$\rm A$单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。

聚乙二醇（$\\rm PEG$）融合法（或灭活病毒诱导法、电融合法）；抗体检测

①诱导动物细胞融合的常用方法有聚乙二醇（$\rm PEG$）融合法、灭活病毒诱导法、电融合法等，这里答出其中一种即可，比如聚乙二醇（$\rm PEG$）融合法。

②选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。