用$\rm PCR$技术对$\rm CD14$蛋白基因进行扩增时，每次循环可分为                  三步，若循环五次，理论上至少需要的引物是                  个。

$\rm PCR$技术每次循环分为变性、复性、延伸三步。变性是在高温下使$\rm DNA$双链解开；复性是在较低温度下，引物与模板链结合；延伸是在$\rm DNA$聚合酶作用下，以脱氧核苷酸为原料合成新的$\rm DNA$链；$\rm PCR$技术中，$\rm 1$个$\rm DNA$分子经过$\rm n$次循环后，得到$\rm 2^{n}$个$\rm DNA$分子。而引物是在$\rm DNA$复制开始时与模板链结合，引导$\rm DNA$合成。最初的模板$\rm DNA$分子不需要引物，从第一次循环开始，每形成一个新的$\rm DNA$分子都需要引物。循环$\rm n$次后，$\rm DNA$分子总数为$\rm 2^{n}$个，除去最初的$\rm 1$个模板$\rm DNA$分子，新合成的$\rm DNA$分子数为（$\rm 2^{n}-1$）个，每个新合成的$\rm DNA$分子都需要引物，所以需要的引物数为$\rm 2\times (2^{n}-1)$。当$\rm n = 5$时，$\rm 2\times (2^{5}-1)=2\times (32 - 1)=62$个；

$\rm CD14$蛋白基因插入载体会形成正向连接和反向连接的两种重组载体，再用$\rm XhoI$和$\rm SalI$酶切对连接方向进行鉴定。若重组载体能被再次切开，则说明接入载体的$\rm CD14$是                 （填“正向”或“反向”），判断的理由是                                                                。

正向；正向连接的重组载体有这两种限制酶的识别序列

若重组载体能被再次切开，则说明$\rm CD14$正向接入载体，原因是：$\rm XhoI$和$\rm SalI$识别的核苷酸序列相同，切割产生的黏性末端也相同。如果$\rm CD14$蛋白基因正向接入载体，那么用$\rm XhoI$和$\rm SalI$酶切时，能在重组载体上找到相应的酶切位点，从而将重组载体再次切开；若反向接入，酶切位点的方向改变，无法被这两种酶再次切开。

从工程菌中提取到的$\rm CD14$蛋白通过①注射给小鼠，取小鼠脾组织用                                                                酶处理，制成细胞悬液培养，处理后离心收集获得小鼠$\rm B$淋巴细胞，与$\rm SP2/0$细胞（一种骨髓瘤细胞）进行融合。用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到$\rm 96$孔板，进行                 培养。

胰蛋白酶或胶原蛋白；克隆化

动物细胞培养时，需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理组织，使细胞分散开，制成细胞悬液；常用的促进动物细胞融合的方法有物理法（如电激）、化学法（如聚乙二醇）、生物法（如灭活的病毒）；将杂交瘤细胞接种到$\rm 96$孔板，进行克隆化培养，目的是筛选出能产生所需特异性抗体的杂交瘤细胞。

图$\rm 2$中，通过过程⑥从小鼠腹腔中提取的抗$\rm CD14$蛋白单克隆抗体可减轻革兰氏阴性细菌入侵导致的炎症反应，其原理是                                                                。

抗$\\rm CD14$蛋白单克隆抗体与$\\rm CD14$蛋白特异性结合，阻止了革兰氏阴性细菌细胞壁的脂多糖（$\\rm LPS$）与$\\rm CD14$蛋白结合，从而减轻炎症反应

抗$\rm CD14$蛋白单克隆抗体能特异性地与$\rm CD14$蛋白结合，从而阻断$\rm LPS$与$\rm CD14$蛋白的识别和结合，进而不能诱发炎症反应，所以可减轻革兰氏阴性细菌入侵导致的炎症反应 。