获取目的基因。狂犬病毒为$\rm RNA$病毒，可通过                 过程获得$\rm cDNA$，进而合成目的基因。

狂犬病毒的遗传物质是$\rm RNA$，可通过逆转录的方法获取目的基因。

设计引物与扩增目的基因。

①根据$\rm S$蛋白的基因序列，设计合成引物。据图$\rm 1$分析，选择的引物为                。若扩增$\rm 5$次，共需要两种引物                个。在$\rm PCR$反应中使用$\rm Taq$ $\rm DNA$聚合酶而不使用大肠杆菌$\rm DNA$聚合酶，推测原因是                                                                。

②$\rm PCR$过程每轮循环中温度最高的一步是                。

Ⅱ、Ⅲ；$\\rm 62$；大肠杆菌$\\rm DNA$聚合酶不耐高温，在高温下会失活；变性

①$\rm PCR$扩增时，需要一对方向相反的引物，且引物应与模板的$\rm 3'$端（$\rm -OH$端）结合，结合图示可知，要扩增目的基因，应选择引物Ⅱ、Ⅲ；若扩增$\rm 5$次，共需要两种引物 $\rm 62$个（计算公式：扩增$\rm n$次需要引物数量为 $\rm {{2}^{n+1}}-2$，即$\rm {{2}^{5+1}}-2=62$）。

②$\rm PCR$的过程包括变性（超过$\rm 90^\circ\rm C$）、复性（$\rm 50^\circ\rm C$左右）、延伸（$\rm 72^\circ\rm C$左右）三步，其中温度最低的是复性。

重组质粒的构建与鉴定。

①经两种限制酶切割后的目的基因和质粒在$\rm DNA$连接酶的作用下连接起来，图$\rm 2$中能正确表示这个过程的图像是                 （填字母）。

②重组质粒经双酶切、电泳分离后，若电泳结果出现                 个条带表明重组质粒构建成功。

①$\rm DNA$分子具有两个末端，有一个游离的磷酸基团的一端和有一个羟基（$\rm -OH$）的一端，$\rm DNA$连接酶能将一个$\rm DNA$片段的磷酸基团端与另一个$\rm DNA$片段的羟基（$\rm -OH$）端相连接，因此$\rm b$正确。

②重组质粒经双酶切、电泳分离后，若电泳结果出现$\rm 2$个条带表明重组质粒构建成功。

$\rm S$蛋白与单克隆抗体的制备。利用基因工程制备的$\rm S$蛋白作为抗原，刺激小鼠使其发生免疫反应；诱导从小鼠脾脏分离的$\rm B$淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合；经过选择培养的杂交瘤细胞必须经过                                                                ，才能获得足够数量的能产生所需抗体的杂交瘤细胞。

克隆化培养和抗体检测

$\rm B$淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后，需要将获得的杂交瘤细胞经过克隆化培养和抗体检测，获得足够数量的能产生所需抗体的杂交瘤细胞。

单克隆抗体效果鉴定。研究人员使用$\rm qPCR$的方法对经单克隆抗体治疗后的小鼠进行狂犬病毒检测，以观察治疗效果。具体方法为：取实验小鼠的$\rm mRNA$在试剂盒中逆转录出$\rm cDNA$并大量扩增，向反应体系加入荧光探针，荧光探针两端连有荧光基团（$\rm R$）和抑制荧光发出的淬灭基团（$\rm Q$），完整的荧光探针不发出荧光，当探针被水解后$\rm R$基团会发出荧光（如图$\rm 3$）。每扩增$\rm 1$个$\rm DNA$分子，就有一个荧光分子形成，随着循环次数的增加，荧光信号强度增加。

①推测图$\rm 3$的$\rm qPCR$过程中，$\rm TaqDNA$聚合酶的作用是                                                                （答出$\rm 2$点）。

②$\rm Ct$值是$\rm PCR$扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，一般来说，单克隆抗体的免疫效价越高，检测样本中病毒浓度较低，此时$\rm Ct$值                （填“较低”或“较高”）。

催化合成$\\rm DNA$子链；催化荧光探针水解，使$\\rm R$基团与$\\rm Q$基团分离；较高

①结合题图可知，$\rm qPCR$过程中，$\rm TaqDNA$聚合酶的两个作用是催化合成$\rm DNA$子链；催化探针水解，使$\rm R$基团与$\rm Q$基团分离。

②结合题干和题图，若单克隆抗体的免疫效价高，说明样本中病毒的数量少，最初有较少的荧光探针与目的基因进行了碱基互补配对，则荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数就会越多（即$\rm Ct$值越高）。