科研人员将抗炎蛋白基因与硫代硫酸盐特异性诱导激活的启动子$\rm P$连接，构建出含图$\rm 1$所示元件的表达载体。先用$\rm Ca^{2+}$处理大肠杆菌细胞，使细胞处于                                                                的生理状态，再将表达载体导入其中，筛选得到菌株$\rm E$。饲喂菌株$\rm E$的$\rm IBD$小鼠症状明显缓解。选用启动子$\rm P$的优点是仅在$\rm IBD$发生时才表达抗炎蛋白且                                                                ，在时机和剂量两方面精准治疗$\rm IBD$。

能吸收周围环境中$\\rm DNA$分子；表达量与$\\rm IBD$程度正相关

利用$\rm Ca^{2+}$处理大肠杆菌细胞，可以使细胞处于一种能够吸收周围环境$\rm DNA$分子的生理状态，即感受态，从而将重组的基因表达载体导入其中；由图$\rm 1$可知，启动子$\rm P$是硫代硫酸盐特异性诱导激活的启动子，因此，只有小鼠患$\rm IBD$，菌株$\rm E$中的抗炎蛋白基因才会表达且精准治疗$\rm IBD$，所以其表达量与$\rm IBD$程度呈正相关。

科研人员拟向菌株$\rm E$中导入新元件，得到菌株$\rm Ec$，以通过观察饲喂菌株$\rm Ec$的小鼠粪便中的荧光情况来诊断$\rm IBD$严重程度。制备新元件有图$\rm 2$所示两种方案。

①与方案$\rm 1$相比，方案$\rm 2$的主要优势是通过观察红色荧光情况排除不同的小鼠粪便样品中$\rm Ec$菌的                差异对诊断结果的影响。

②利用方案$\rm 2$所获得的$\rm Ec$菌饲喂$\rm IBD$小鼠后，若粪便样品中同时发红色和绿色荧光的菌为$ x$个，仅发红色荧光的菌为$ y$个，则反映$\rm IBD$发病程度的数学表达式为                。

数量和活性；$x/(x+y)$

①由图$\rm 2$可知，方案$\rm 1$中的诱导型启动子只有在$\rm IBD$发生时才会表达绿色荧光蛋白基因，绿色荧光蛋白的数量受$\rm Ec$菌株数量和$\rm Ec$菌活性差异的影响，因此与方案$\rm 1$相比，方案$\rm 2$的主要优势是通过观察红色荧光情况排除不同的小鼠粪便样品中$\rm Ec$菌的数量和活性差异对诊断结果的影响。

②方案$\rm 2$中，因为有持续表达启动子$\rm Pc$，在未受到$\rm IBD$诱导的时候，菌株$\rm Ec$表达红色荧光蛋白基因，当受到$\rm IBD$诱导时，$\rm Ec$既表达红色荧光蛋白基因，也表达绿色荧光蛋白基因，如此，$\rm IBD$的患病程度就可以利用同时发红色和绿色荧光的工程菌的数量与所有发荧光的工程菌的数量之比表示，即$ x/(x+y)$。

硫代硫酸盐易被分解，因此$\rm Ec$菌荧光情况的观察只能反映观察时刻的情况。为了让曾经患过$\rm IBD$的情况被记录下来，科研人员继续向菌株$\rm Ec$中导入含图$\rm 3$所示元件的表达载体，得到智能工程菌$\rm R$。正常的$\rm LacZ$基因编码的蛋白可使大肠杆菌菌落在含$\rm X-gal$（无色）的培养基上呈现蓝色。突变基因$\rm A-LacZ$无法表达$\rm LacZ$酶，$\rm B-sgRNA$能使突变基因$\rm A-LacZ$恢复正常序列。

给小鼠饲喂智能工程菌$\rm R$后，收集小鼠粪便中的工程菌$\rm R$，将工程菌$\rm R$涂布在含                的平板上，若                ，则说明小鼠曾患$\rm IBD$。

$\\rm X-gal$；出现蓝色菌落

由图$\rm 3$可知，当小鼠患$\rm IBD$时，启动子$\rm P$会让$\rm B-sgRNA$基因表达，从而使突变基因$\rm A-LacZ$恢复正常序列，即$\rm LacZ$基因会编码蛋白质使大肠杆菌菌落在含$\rm X-gal$（无色）的培养基上呈现蓝色（出现蓝色菌落），从而记录下曾经患过$\rm IBD$的情况。

为将工程菌$\rm R$应用于临床医疗实践，请至少从两个不同角度各提出一个需要进一步研究的问题                                                                。

研究$\\rm R$菌对人类肠道稳态是否有负面影响、工程菌$\\rm R$的遗传稳定性、$\\rm R$菌是否会对环境产生影响等

工程菌的结构、功能研究清楚后，下一步就是用于人类的疾病治疗，所以需要研究$\rm R$菌对人类肠道稳态是否有负面影响、工程菌$\rm R$的遗传稳定性、$\rm R$菌是否会对环境产生影响等从而进行进一步的研发。