为研究高粱盐碱响应通路中相关基因$\rm AT1$的作用，研究人员构建过表达植株（$\rm AT1-OE$）。以高粱$\rm cDNA$为模板，利用                方法获取目的基因。如图$\rm 1$，选取最佳限制酶                处理目的基因和质粒，构建重组质粒并转入农杆菌。将转化成功的农杆菌与高粱愈伤组织共培养，筛选$\rm T-DNA$成功转入的愈伤组织，使用既能杀死原核细胞，又能杀死真核细胞的潮霉素，效果优于仅能杀死原核细胞的抗生素（如卡那霉素），原因是                。进一步筛选获得所需愈伤组织，经                发育成完整植株。同时构建基因敲除植株（$\rm AT1-KO$）。

$\\rm PCR$ ；$Bam\\rm H$ Ⅰ和$Eco\\rm R$ Ⅰ；未转入$\\rm T-DNA$的植物细胞无法生长；再分化

以高粱$\rm cDNA$为模板，利用$\rm PCR$技术可获得目的基因；为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，需要用两种酶进行切割，据图可知，$Xho$Ⅰ会破坏标记基因，故不能选择，结合目的基因和质粒的限制酶位点可知，$Bam\rm H$Ⅰ和$Eco\rm R$Ⅰ为最佳限制酶；$\rm T-DNA$能够将目的基因导入受体细胞并整合到受体细胞的染色体$\rm DNA$上，故使用既能杀死原核细胞，又能杀死真核细胞的潮霉素筛选时，未转入$\rm T-DNA$的植物细胞无法生长，筛选效果会优于仅能杀死原核细胞的抗生素；植物组织培养过程中，由愈伤组织培育为完整植株的过程是再分化。

检测植株在高碱土壤中的幼苗长势和作物产量，结果发现：相比野生型植株，$\rm AT1-KO$植株                                                                ，$\rm AT1-OE$植株表型相反，说明$\rm AT1$在高粱碱胁迫的响应过程中起负调控作用。

分析题意可知，基因敲除植株是$\rm AT1-KO$，而过表达植株是$\rm AT1-OE$，野生型是对照组，若$\rm AT1$在高粱碱胁迫的响应过程中起负调控作用，则预期结果应为：相比野生型植株，$\rm AT1-KO$植株幼苗长势好、作物产量高，$\rm AT1-OE$植株表型相反。

高碱条件下，植物细胞内$\rm H_{2}O_{2}$含量升高，推测$\rm AT1$可能与运输$\rm H_{2}O_{2}$的通道蛋白$\rm PIP2$有相互作用。利用免疫共沉淀方法进行研究，实验原理如图$\rm 2$，若靶蛋白$\rm A$和待测蛋白$\rm B$有相互作用，用磁珠偶联抗$\rm A$抗体使$\rm A$沉淀，则$\rm B$也会被沉淀下来。利用抗$\rm GFP$抗体与磁珠偶联，对实验组和对照组总蛋白进行免疫共沉淀，实验结果如图$\rm 3$。

①检测总蛋白的目的是                                                                。

②通过条带                可以判断，$\rm AT1$与$\rm PIP2$有相互作用。若想进一步验证该相互作用，可用                抗体与新磁珠偶联再次进行实验。

确保免疫共沉淀前的样品中有靶蛋白$\\rm A$和待测蛋白$\\rm B$；$\\rm 3$；抗$\\rm PIP2$

①结合题意“若靶蛋白$\rm A$和待测蛋白$\rm B$有相互作用，用磁珠偶联抗$\rm A$杭体使$\rm A$沉淀，则$\rm B$也会被沉淀下来”可知，该过程中靶蛋白$\rm A$和待测蛋白$\rm B$是重要检测目标，故检测总蛋白的目的是确保免疫共沉淀前的样品中有靶蛋白$\rm A$和待测蛋白$\rm B$。

②据图可知，对总蛋白进行抗$\rm PIP2$抗体检测时对照组和实验组均有条带$\rm 3$出现，转入空质粒的对照组对免疫共沉淀蛋白进行抗$\rm PIP2$抗体检测时无条带$\rm 3$出现，而转入重组质粒的实验组有条带$\rm 3$出现，说明$\rm AT1$与$\rm PIP2$有相互作用，能够相互反应、结合；由于实验假设是$\rm AT1$可能与运输$\rm H_{2}O_{2}$的通道蛋白$\rm PIP2$有相互作用，若想进一步验证该相互作用，可用抗$\rm PIP2$抗体与新磁珠偶联再次进行实验。

细胞内过量的$\rm H_{2}O_{2}$积累会导致氧化应激，从而导致植物细胞死亡，降低植物存活率。研究显示$\rm PIP2$磷酸化能够促进$\rm H_{2}O_{2}$外排。综合上述信息，解释敲除$\rm AT1$基因能显著提高植株耐盐碱性的原因是                                                                。

高碱环境中$\\rm AT1$与$\\rm PIP2$相互作用抑制其磷酸化，从而抑制$\\rm H_{2}O_{2}$外排，导致植物细胞死亡；敲除$\\rm AT1$基因后，$\\rm PIP2$磷酸化上升，促进$\\rm H_{2}O_{2}$外排，作物存活率提高。

分析题意，$\rm PIP2$磷酸化能够促进$\rm H_{2}O_{2}$外排，综合上述信息，敲除$\rm AT1$基因能显著提高植株耐盐碱性的原因是：碱环境中$\rm AT1$与$\rm PIP2$相互作用抑制其磷酸化，从而抑制$\rm H_{2}O_{2}$外排，导致植物细胞死亡；敲除$\rm AT1$基因后，$\rm PIP2$磷酸化上升，促进$\rm H_{2}O_{2}$外排，作物存活率提高。