科研人员利用打靶载体敲除小鼠$\rm R$基因，载体构建及$\rm R$基因敲除过程如图$\rm 1$所示。

①为构建能够敲除$\rm R$基因的打靶载体，需先设计引物，通过$\rm PCR$技术扩增$\rm R$基因。在引物上添加$\rm PstI$限制酶识别序列，据图$\rm 1$应选择的引物是                （选填图$\rm 1$中的$\rm a$，$\rm b$，$\rm c$或$\rm d$）。将得到的$\rm PCR$产物酶切后连入打靶空载体，鉴定正确后进行后续实验。

②为将抗生素抗性基因$\rm neo$（抵抗抗生素$\rm G418$）从原有载体中切下以插入到$\rm R$基因中，据图$\rm 1$及下表中限制酶识别位点序列信息，应选择限制酶                分别对$\rm R$基因和$\rm neo$基因进行酶切，并用                连接，完成打靶载体构建。

限制酶	$ Kpn$Ⅰ	$ Mfe$ Ⅰ	$Hin\rm d$ Ⅰ	$Eco\rm R$ Ⅰ	$Bam\rm H$ Ⅰ
识别序列及切割位点

③将构建好的打靶载体通过                法导入小鼠受体细胞中。据图$\rm 1$，受体细胞基因组中的$\rm R$基因通过                被替换为打靶载体上插入$\rm neo$的$\rm R$基因片段。未整合到基因组的外源$\rm DNA$会被降解。

$\\rm a$和$\\rm d$；$Eco\\rm R$ Ⅰ和$Mfe$ Ⅰ（顺序不可颠倒）；$\\rm DNA$连接酶；显微注射；交换（或同源重组）

①$\rm DNA$聚合酶只能从引物的$\rm 3'$端开始连接脱氧核苷酸，因此限制酶$Pst$Ⅰ识别序列应该添加在引物的$\rm 5'$端，同时引物只能与模板链的$\rm 3'$端结合，引物与模板链是反向平行的关系，引物$\rm d$右侧是$\rm 5'$端，该端连有限制酶$Pst$Ⅰ识别序列，左侧是$\rm 3'$端，从$\rm 3'$端向左延伸$\rm DNA$链可进行$\rm R$基因上面一条链的$\rm PCR$扩增，同理，引物$\rm a$左侧是$\rm 5'$端，该端连有限制酶$Pst$Ⅰ识别序列，右侧是$\rm 3'$端，从$\rm 3'$端向右延伸可进行另一条链的扩增，所以应该选择引物$\rm a$和$\rm d$。

②由图可知，$\rm R$基因内部有$Hin\rm d$ Ⅲ、$Eco\rm R$ Ⅰ和$Bam\rm H$ Ⅰ的识别位点，因此切割$\rm R$基因必须在这三种限制酶之间选择；$\rm neo$基因两侧具有$Mfe$ Ⅰ和$Kpn$ Ⅰ的识别序列，切割$\rm neo$基因只能在这两种限制酶之间选择，根据表中各种限制酶识别序列可知，只有$Mfe$ Ⅰ与$Eco\rm R$ Ⅰ切割得到的黏性末端相同，都为$\rm AATT-3'$，因此可用$Eco\rm R$ Ⅰ切割$\rm R$基因，用$Mfe$ Ⅰ切割$\rm neo$基因，得到相同黏性末端之后再用$\rm DNA$连接酶将其连接，即可将$\rm neo$基因插入到$\rm R$基因中，完成打靶载体构建。

③将目的基因导入受体细胞时，若受体细胞是动物细胞，常采用显微注射法。将打靶载体导入受体细胞后，打靶载体上的插入$\rm neo$的$\rm R$基因与受体细胞基因组中的$\rm R$基因发生交换（或同源重组），从而实现基因之间的替换。

打靶载体也可能整合到受体细胞基因组$\rm DNA$的其他部位，引发$\rm TK$基因表达，使细胞在加入物质$\rm G$的培养基上无法存活。在选择培养基中除有动物细胞培养的必需成分外，还需加入                                                                和物质$\rm G$，可筛选出成功敲除$\rm R$基因的受体细胞，其原因是                                                                。

$\\rm G418$ 敲除$\\rm R$基因的受体细胞基因组$\\rm DNA$含有$\\rm neo$基因；无$\\rm TK$基因，使其具有$\\rm G418$抗性，且可在含物质$\\rm G$的培养基上可存活。

打靶载体也可能整合到受体细胞基因组$\rm DNA$的其他部位，引发$\rm TK$基因表达，使细胞在加入物质$\rm G$的培养基上无法存活。在选择培养基中除有动物细胞培养的必需成分外，还需加入$\rm G418$和物质$\rm G$，可筛选出成功敲除$\rm R$基因的受体细胞，其原因是敲除$\rm R$基因的受体细胞基因组$\rm DNA$含有$\rm neo$基因， 无$\rm TK$基因，使其具有$\rm G418$抗性，且可在含物质$\rm G$的培养基上可存活。

图$\rm 2$为小鼠视觉形成的部分机理简图，研究发现$\rm R$蛋白通过图中所示方式参与小鼠视觉形成。

科研人员基于上述方法获得了$\rm R$基因敲除的纯合小鼠，将野生型小鼠和$\rm R$基因敲除小鼠都平均分成两组，一组在黑暗中饲养$\rm 12\;\rm h$，另一组在光照下饲养$\rm 12\;\rm h$；测定小鼠眼睛中各物质含量，结果如图$\rm 3$所示。

据图$\rm 2$机理，预测并在答题纸中画出图$\rm 3$中在光照条件下两种小鼠全反式视黄醛的含量                。

由图$\rm 2$可知，视蛋白与顺式视黄醇结合生成视紫红质，视紫红质在光下分解为视蛋白和全反式视黄醇，进一步激活视觉信号，产生视觉，同时全反式视黄醇可在多种酶和$\rm R$蛋白作用下转化为顺式视黄醇。由图$\rm 3$可知，在光照条件下，$\rm R$基因敲除小鼠的顺式视黄醇含量低于野生型小鼠，且视紫红质含量也少于野生型小鼠，推测是由于$\rm R$基因敲除小鼠体内缺少$\rm R$基因，导致无法表达$\rm R$蛋白，由于全反式视黄醇转变为顺式视黄醇需要$\rm R$蛋白参与，$\rm R$蛋白无法形成，则会导致全反式视黄醇转变为顺式视黄醇受阻，因此$\rm R$基因敲除小鼠的顺式视黄醇含量减少，视紫红质也随之减少，同时也可以推出，$\rm R$基因敲除小鼠的全反式视黄醇积累，从而含量高于野生型小鼠，可表示为下图：