获得胰岛素基因的方法有多种，如根据胰岛素的氨基酸序列人工合成$\rm DNA$片段，或者利用人体                细胞中的$\rm mRNA$                得到胰岛素基因。前者人工合成$\rm DNA$片段有多种可能的序列，原因是                                                                。

胰岛$\\rm B$；逆转录（反转录）；一种氨基酸可能对应多种密码子（密码子的简并性）

胰岛素基因在人体胰岛$\rm B$细胞中进行表达，可利用人体胰岛$\rm B$细胞中的$\rm mRNA$进行逆转录得到胰岛素基因。前者人工合成$\rm DNA$片段有多种可能的序列，原因是密码子具有简并性，一种氨基酸可能对应多种密码子；

为使目的基因与载体$\rm E$正确连接，在设计$\rm PCR$引物时可将限制酶的识别序列添加在$\rm PCR$两种引物的                 （选填“$\rm 3'$”或“$\rm 5'$”）端，与$\rm a$链相结合的引物上添加的是限制酶                 的识别序列。

$\rm PCR$扩增时与引物的$\rm 3'$端结合，为了能够将目的基因与载体$\rm E$相连，可以在上述引物的$\rm 5^\prime$端添加能产生黏性末端的限制酶识别序列，根据质粒（图$\rm 1$）载体$\rm E$，目的基因的部分结构（图$\rm 2$）及相关限制酶的识别序列（图$\rm 3$），与$\rm a$链相结合的引物上添加的是限制酶$Pst$Ⅰ的识别序列。

由于$\rm PCR$扩增出的目的基因末端为平末端，如果不在目的基因的两端添加合适的限制酶识别序列，还可借助中间载体$\rm P$将目的基因接入载体$\rm E$。构建重组载体$\rm P$时，应选择                酶进行剪切，再用                连接酶进行连接。为了便于该目的基因接入载体$\rm E$，可用限制酶                切割重组载体$\rm P$。

$Eco\\rm R$Ⅴ；$\\rm T4DNA$；$Xho$Ⅰ、$ Pst$Ⅰ

由于$\rm PCR$扩增出的目的基因末端为平末端，如果不在目的基因的两端添加合适的限制酶识别序列，还可借助中间载体$\rm P$将目的基因接入载体$\rm E$。构建重组载体$\rm P$时，应选择$\rm EcoRV$将载体$\rm P$切开，形成平末端，由于$\rm T4DNA$连接酶可以连接平末端，所以用$\rm T4DNA$连接酶将$\rm M$基因与载体$\rm P$相连，构成重组载体$\rm P$，为了便于该目的基因接入载体$\rm E$，结合载体$\rm E$上的基因片段以及图$\rm 3$，可用限制酶$Xho$Ⅰ、$Pst$Ⅰ切割重组载体$\rm P$，产生相同的黏性末端；

（重组）载体$\rm P$                （选填“能”或“不能”）作为基因表达载体，理由是                                                                。

不能；没有启动子和终止子，无法表达目的基因的产物

载体$\rm P$不能作为基因表达载体，因为它没有启动子和终止子结构，无法进行转录，无法表达目的基因的产物。

科研人员需在细胞培养基中加入一定浓度的                 以筛选导入重组质粒$\rm E$的受体细胞。

载体$\rm E$含有$\rm Neo^{r}$ 新霉素抗性基因，科研人员需在细胞培养基中加入一定浓度的氨苄青霉素可筛选导入重组质粒$\rm E$的受体细胞。

已知由扩增后的基因先与载体$\rm P$连接后得到重组质粒$\rm E$的长度为$\rm 8.9kb$，依据图中数据分析可知目的基因的长度为                 $\rm kb$。

已知由扩增后的基因先与载体$\rm P$连接后得到重组质粒$\rm E$的长度为$\rm 8.9kb$，$ Eco\rm R$Ⅴ将载体$\rm P$酶切，目的基因的长度为$\rm 8.9-5.3-2.8=0.8kb$。